在食物源型肉毒中毒中，神经肌肉失调的类型以及摄入可疑食物可为诊断提供重要线索。同时有2例或更多的患者在摄入同一食物后发病可以简化诊断，确诊需要在患者的血清或粪便中找到肉毒毒素，或从粪便中分离到该菌。在可疑食物中找到肉毒毒素可确定其为传染源。家中宠物摄入相同的污染食物后也可能发生肉毒中毒。
对创伤型肉毒中毒，在血清中找到毒素或从伤口处分离并在厌氧条件下培养出肉毒杆菌可明确诊断。
婴儿型肉毒中毒需与脓毒症，先天性肌营养不良，脊柱肌肉萎缩，甲状腺功能减退及良性先天性肌张力减低相鉴别.在粪便中找到肉毒毒素或该菌可确诊。
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